Telur ayam berembrio adalah salah satu metode yang paling ekonomis dan mudah untuk kultivasi berbagai macam virus. Telur ayam yang subur atau berembrio yang telah diinkubasikan selama 5 sampai 12 hari dapat diinokulasi melalui kulitnya secara aseptik. Lubang dapat ditutup dengan lilin parafin dan telurnya diinkubasikan pada 36 0 C selama jangka waktu yang dibutuhkan untuk pertumbuhan virus.


Pembuatan suspensi virus:


  • Ayam sakit diperiksa dan diperhatikan gejala klinis yang menonjol
  • Ayam kemudian dibedah diambil organ – organ predileksi spesifik yang erat kaitannya dengan gejala penyakit
  • Organ digerus di dalam mortir dengan ditambahkan PBS 1: 4
  • Kemudian dimasukkan ke dalam tabung untuk disentrifuse ( 15 menit 3000 rpm) terbentuk 2 lapisan yaitu endapan dan supernatan
  • Kemudian supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung baru
  • Kemudian ditambahkan antibiotika dan antifungi broadspectrum
  • diinkubasi selama 3 jam 37 0 C.
  • Untuk mengetahui kemungkinan adanya kontaminasi dilakukan penanaman pada media pertumbuhan bakteri
  • Kemudian diinkubasi selama 18 – 24 jam dalam inkubator suhu 37 0 C
  • Selanjutnya diamati ada pertumbuhan bakteri atau tidak
  • Apabila tidak ada berarti suspensi virus yang diperoleh layak ditanam ke dalam telur ayam berembrio (TAB SPF).
Mempersiapkan TAB:

  • Periksalah telur-telur berembrio yang telah dieramkan 10-14 hari lamanya dengan lampu di kamar gelap, apakah mati atau hidup (egg candling).
  • TAB-TAB yang hidup dikumpulkan untuk diinokulasi.
  • Beri tanda dengan pensil dimana letak kepala embrio dan batas rongga hawa agar lokasi inokulasi benar.
Inokulasi suspensi virus:

  • Telur diletakkan pada nampan telur dengan posisi rongga hawa di atas, kemudian telur didesinfeksi pada daerah di atas rongga hawa dan dibuat lubang di daerah tersebut.
  • Dengan menggunakan suntikan diinokulasikan 0,1 – 0,3 ml inokulum, dengan cara memasukkan jarum secara vertikal ke dalam lubang sedalam panjang jarumnya. Jika jarum telah dimasukkan dalam telur tidak boleh digerakkan, untuk menghindari robeknya CAM yang dapat menyebabkan perdarahan dan kematian embrio.
  • Lubang disegel dengan parafin dan telur dikembalikan ke dalam inkubator umumnya selama 2-3 hari (virus ND) untuk kemudian diamati pertumbuhan embrio, perubahan yang terjadi, dan cytophatic effect (CPE) yang ada.
Panen virus
  • Desinfeksi kutub tumpul dari telur – telur berembrio dengan menggosokkan alkohol lalu di sulut dengan api, desinfeksi dapat pula menggunakan alkohol 70 % ditambah biocid atau jodium tincture
  • Dengan pinset yang tajam kita pecahkan kerabang telur lalu dibuat lubang sebesar atau lebih sedikit dari rongga hawa, jika perlu diambil membran korio allantois maka dengan memakai gunting kita gunting selaput tadi berbentuk bundaran menurut kehendak kita
  • Dengan pinset tekanlah embrio kesamping akan terlihat cairan korio allantois di sisi embrio, isaplah cairan dengan pompa suntik 5 ml
  • Teteskan 0,25 ml cairan ke dalam pompa suntik ke dalam perbenihan kaldu dan pada pelat agar darah untuk menguji ada tidaknya pertumbuhan bakteri.
Setelah panen virus kemudian dilakukan uji untuk membuktikan virus yang tumbuh adalah virus yang dimaksud sesuai sengan diagnosis sementara. Contohnya pada virus ND dapat dilakukan uji HA-HI dan uji AGP.
Jika hanya sebatas mengetahui apakah virus yang tumbuh adalah virus yang dimaksud atau bukan maka hanya dilakukan uji HA-HI cepat. Tujuan uji HA cepat adalah untuk mengetahui apakah virus tersebut dapat menghemaglutinasi eritrosit ayam 2,5%. Jika hasilnya positif maka dilanjutkan dengan identifikasi virus dengan metode HI cepat berdasarkan antibodi yang digunakan. Maksudnya jika untuk menguji virus ND maka harus dipakai antibodi terhadap virus ND.



Cara uji HA cepat

  • Objek glass ditetesi dengan satu tetes cairan korio allantois yang mengandung virus di dua tempat
  • Didekat tetesan tersebut ditetesi suspensi eritrosit ayam 2,5 % dan 1 tetes lagi di tempat yang berjauhan sebagai kontrol
  • Objek glass di goyang – goyang tunggu 5 menit amati bandingkan dengan kontrol.
    Hasil: HA(+) akan terjadi hemaglutinasi yaitu terlihat agregat-agregat eritrosit yang berkeping-keping yang menandakan bahwa virus tersebut mampu menghemaglutinasi eritrosit.
Cara uji HI cepat
1. Cairan korio allantois diteteskan pada 2 tempat yang terpisah pada objek glass
2. Satu tetes serum anti ND diteteskan pada salah satu cairan korio allantois
3. Dicampur tunggu selama 5 menit
4. Eritrosit ayam diteteskan pada kedua tetesan
5. Dicampur, tunggu selama 5 menit dan amati
Hasil: jika HI(+) tidak akan terjadi aglutinasi (hasil berlawanan dengan uji HA) yang menandakan bahwa kemampuan virus untuk menghemaglutinasi telah dihambat oleh serum anti ND.


Uji Agar Gel Presipitation
Uji ini bertujuan untuk mengetahui reaksi antara antigen dan antibodi pada medium agar semisolid. Dalam percobaan ini terdapat 3 sumuran pada agar, sumuran tengah ditetesi dengan antibodi virus ND dua sumuran yang lain ditetesi antigen virus kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 1-2 hari. Uji positif diinterpretasikan oleh adanya garis preipitat yang merupakan presipitasi ikatan kompleks antigen antibodi yang berarti bahwa antibodi sesuai denganantigen. Keberhasilan uji ini sangan dipengaruhi oleh kelembaban, suhu, konsentrasi antigen-antibodi yang diteteskan dan kondisi lingkungan sekitarnya.

Cara kerja uji presipitasi Agar

1. Siapkan kaca benda bersih dari kotoran dan lemak.
2. Diatas kaca benda ditambahkan 3 ml 0,3 % larutan agar dalam air ( larutan agar dipanaskan pada penangas air yang mendidih )
3. Setelah agar memadat kaca benda ditempatkan dalam oven 80 0 C sampai agar kering atau ditempatkan dalam inkubator 37 0 C sampai agar kering
4. Tempatkan kaca benda yang sudah dilapisi agar di meja datar
5. Tambahkan diatas kaca benda larutan agar 1 % dalam 8,5 % NaCl dalam PBS dan ditambah 0,1 % phenol sebagai pengawet
6. Agar dibiarkan mengeras
7. Setelah agar mengeras dibuat sumuran di tengah dengan dikelilingi dua sumuran disekitarnya 8. Teteskan 0,05 ml anti virus ND di tengah sumuran sedangkan pada sumuran disekitarnya diteteskan 0,05 ml suspensi ND
9. Tempatkan kaca benda pada cawan petri dengan kertas basah atau kapas basah dan batang kaca untuk menempatkan kaca benda
10. Tempatkan kaca benda pada meja datar dan amati terjadinya presipitasi diantara sumuran antigen dan antibodi yaitu dengan adanya garis presipitasi.

Cara-cara uji untuk deteksi antigen atau antibodi pada virus lain

  • ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)
    Indikator teknik ELISA adalah reaksi yang terjadi antara antibodi berlabel enzim dan substrat, saat ini telah tersedia beberapa macam enzim seperti horse radish peroxidase (HRP), β-galaktosidase, urease, oksidase glukose dan alkali phosphatase (AP). Matriks yang umum digunakan dalam ELISA adalah matriks padat. Antigen dan antibodi teradsorbsi secara pasif pada permukaan padat dari matriks dan dapat diikatkan dengan berbagi teknik Cara kerja ELISA :
    1. Mikrotiter plate di coating dengan 100 µl antigen (5µg/ml dalam coating buffer) dan diinkubasikan semalam pada suhu 40C.
    2. Cuci plate 2 x dengan washing solution, 200 µl/sumuran.
    3. Blocking dengan blocking buffer, 200 µl/sumuran selama 1 jam.
    4. Cuci plate 1 x dengan washing solution, 200 µl/sumuran.
    5. Inkubasi dengan serum antibodi (primer antibodi) 100 µl/sumuran selama 1 jam pada suhu 370C.
    6. Cuci plate 4 x dengan washing solution, 200 µl/sumuran.
    7. Tambahkan antibodi monoklonal antigoat / sheep IgG–alkaline phosphatase conjugated (1 : 5000 dengan bufer inkubasi).
    8. Cuci plate 3 x dengan washing solution, 200 µl/sumuran.
    9. Tambahkan larutan substrat sebanyak 150 µl/sumuran.
    10. Baca absorbansi pada OD 405 nm setelah inkubasi 30 menit. Selain metode ELISA masih ada metode yang lain seperti RIA, Immunohistokimia, dan CFT (Complement Fixation Test).